وبلاگ

     اكثر سروتیپ‌های سالمونلا پاتوژن‌های بالقوه برای انسان و بسیاری از حیوانات می‌باشند. این باكتری‌ها در دستگاه گوارش مهره‌داران اعم از پستانداران و پرندگان و خزندگان و ماهی‌ها سیطره پیدا كرده، بسته به سروتیپ، شرایط و عوامل متعدد میزبانی، بیماری­هایی با نشانه‌های گوناگون و عوارض متفاوت ایجاد می‌كنند .(Merchant & Pocker, 1983)از جمله باكتری­های روده­ایی­ هستند كه موجب بیماری تب تیفوئید(حصبه)، تب شبه حصبه و بیماری­های ناشی از مواد غذائی در انسان می­گردند(Jay et al., 2005).

 

 

     بیماری­های ناشی از آلودگی مواد غذائی ناشی از سالمونلا را non typhoidal نامیده­اند. سالمونلا به­طور گسترده­­ایی در محیط زیست از قبیل آب، خاك و مدفوع حیوانات توزیع شده است (Cidrp, 2009). باكتری معمولاً از طریق مدفوع انسان و یا دام دفع شده و باعث آلودگی آب و غذا و محیط می‌گردد. مواد غذائی مانند گوشت، تخم­مرغ، مرغ، سس مایونز، سبزیجات و غیره ،از ناقل­های اولیه عفونت سالمونلا به انسان هستند(Dolye & Beuchat, 2007)..

   سالمونلای غیر­تیفوئیدی علت اصلی بیماری­های ناشی از مواد غذائی در سراسر جهان است. كه بر­آورد شده كه حدود 4/1 میلیون مورد در سال مورد عفونت غذائی سالمونلا قرار می­گیرند(Mead et al., 1999).

 

 

از این­رو شناخت و تشخیص به موقع سالمونلا از اهمیت خاصی برخوردار است. با ذكر تمامی این موارد به نظر می‌رسد تشخیص به موقع و كنترل باكتری از وظایف مهم آزمایشگاه‌های میكروب‌شناسی است. امروزه از 3 روش رایج به تشخیص باكتری می‌پردازند:

 

 

ـ روش‌های كشت سنتی و آزمایشات بیوشیمیایی.

 

 

ـ روش‌های سرولوژیكی.

 

 

ـ روش‌های مولكولی.

 

 

     برای تشخیص استفاده از روش­های سنتی مبتنی بر محیط كشت قابل قبول است ولی وقت­گیر است و برای تایید جواب نهایی چند روز به­طول می­انجامد .(Andrews & Hammack, 2007) علاوه­بر این، روش­های ایمنولوژیك مانند الایزا وIMS نیز برای شناسائی سالمونلا توسه یافته­اند.

 

 

. (Mansfield & Forsythe, 2000 ; FAVRIN , 2001) با این­حال اختصایت كم و هزینه­های بالا، استفاده ازین روش­ها را محدود كرده است. اخیرا روش­های مولكولی مانند PCR و real time PCR به­طور گسترده در شناسائی سالمونلا استفاده می­شوند كه روش­هایی كارآمد و حساس هستند.

 

 

Krascsenicsova et al., 2008) ; Eriksson & Aspan, 2007).

 

 

     با این­حال این روش­ها نیازمند سیكل حرارتی اختصاصی و دستگاه­های گران­قیمت­اند. از­این­رو نیاز به یك روش دقیق، حساس، آسان و به­صرفه­تر است. در سال 200 یك گروه ژاپنی یك روش تشخیص مولكولی به نام LAMP را معرفی كردند .(Notomi et al., 2000)از آن زمان روش LAMP به عنوان یك روش اختصاصی، حساس و سریع برای شناسائی پاتوژن­های ناشی از مواد غذائی مورد استفاده است. یك روش ساده، بدون نیاز به سیكل حرارتی اختصاصی و دستگاه­های گران­قیمت و به آسانی قابل اجرا است(Hara-Kudo et al., 2005; Notomi et al., 2000).

 

 

     هدف این تحقیق شناسائی باكتری سالمونلا تیفی در سالاد سبزیجات و سس مایونز آلوده با استفاده از روش LAMP، به­عنوان روشی سریع، حساس و اختصاصی می­باشد.

 

 

اهداف تحقیق در نگاه اجمالی

 

 

 

1. طراحی و بهینه­سازی روش LAMP بر اساس ژن تهاجمی invA سالمونلا تیفی

 

 

1. تعیین حد حساسیت روش PCR و LAMP به روی ژن تهاجمی invA سالمونلا تیفی

 

 

1. مقایسه دو روش PCR و LAM

 

 

 

 

• مشخصات جنس سالمونلا

 

 

1-1-2- تاریخچه

 

 

در سال 1885 یك دامپزشك آمریكائی به نام دانیل المر سالمون برای اولین بار این باكتری را از خوك جدا كرد وآن را باسیلوس كلرا­سوئیس[1] نامید. در سال 1888 جرم دیگری توسط گارتنر از فردی كه در اثر گاستروانتریت ناشی از مصرف گوشت نپخته مرده بود جدا شد و آن­را باسیلوس انتریتیدیس نامید كه بعداً سالمونلا انتریتیدیس خوانده شد. در سال 1900 خواص این باكتری توسط فردی به نام لینیر به­طور رسمی تصویب گردید. از آنجا كه این ارگانیسم ها شبیه به باكتری های جدا شده توسط سالمون بودند، به همین جهت به افتخار كاشف اولیه این باكتری سالمونلا[2] نامیدند(Roumagnac et al., 2006).

 

 

     در فاصله بین سال­های 1925ـ1900 بزرگ­ترین رویداد در كشف سرولوژیكی آنتی‌ژن‌های سوماتیك و فلاژلا در مورد گروه سالمونلا بوسیله لیگنیرز انجام شد. در سال 1926 تركیبات پادگنی سالمونلا طبقه‌بندی گردید و جدولی به نام جدول كافمن ـ وایت ایجاد شد. در حال حاضر این جدول دارای حدود 2500 سروتیپ است (Bhatia & Nabb , 1980) .

 

 

     سالمونلا بطور گسترده در طبیعت توزیع شده است مانند آب آلوده، خاك حاوی مدفوع حیوانات و غیره. به طور عمده این باكتری­ها در روده­ی حیوانات ساكن است و مخزن اصلی آلودگی مرغ، تخم مرغ، دام، حیوانات خانگی و خزندگان است(Cidrp, 2009).

 

 

 2-1-2- خواص شكلی

 

 

اعضای جنس سالمونلا باكتری­های میله­ای شكل و اندازه­ی آن 5-2 ´5/1-7 /. میكرون بوده است.گرم منفی، بدون اسپور و متعلق به خانواده­ی انتروباكتریاسه­اند (J. Antonio , 2009 ; Dolye & Beuchat, 2007) .. اكثر اعضای این جنس متحرك و با تاژه­ی پری­تریش­اند به­جز چند مورد استثناء مانند سالمونلا گالیناروم[3] و سالمونلا پولوروم[4] (et al., 2005 Hara-Kudo).

 

 

3-1-2- خواص بیوشیمیایی

 

 

اعضای این جنس قادر به تخمیر گلوكز بوده ولی از تخمیر ساكارز و لاكتوز نا­توانند. بیشتر انواع سالمونلا ها گلوكز، مالتوز، مانیتول، دولسیتول، دكسترین و سوربیتول را تخمیر می كنند و اسید و گاز بوجود می آورند. اكثر سویه­ها H2sرا از منبع سولفوری معدنی تولید كرده و تولید H2S یکی از واکنش های کلیدی در تشخیص سالمونلاها می­باشد. به استثنای سروتیپ تیفی[5] در بیشتر موارد جدا شده از گلوکز گاز ایجاد می­کنند. در سیترات به عنوان تنها منبع كربن رشد می­كنند اما برخی از گونه ها مانند سالمونلاتیفی و سالمونلا پاراتیفی A سیترات منفی هستند Aksoy, 2004)). این باكتری اكسیداز منفی و كاتالاز مثبت بوده. از تولیدات این باكتری لیزین در كربوكسیلات، سولفات هیدروژن وارنیتین می‌باشد.

 

 

( Alcamo , 1997 ; Connie & Manuselis, 2000) .

 

 

 

 

   از دیگر ویژگیهای بیوشیمیایی این است كه اكثر سالمونلاها عدم تولید اندول، عدم تولید آنزیم‌های اوره آز،   لیپاز، دزاكسی ریبونوكلئاز، فنیل‌آلانین و تریپتوفان دآمیناز، دكربوكسیلاسیون اسیدهای آمینه لیزین، اورنیتین و آرژنین، واكنش مثبت در آزمایش متیل‌رد(MR) و واكنش منفی در آزمایش وژس ـ پروسكوئر (VP) مثبت می‌باشد.( (Alcamo , 1997 ; Dolye & Beuchat , 2007.

 

 

 4-1-2- مقاومت در برابر عوامل فیزیكی و شیمیایی

 

 

این باكتری روی محیط كشت ماهها زنده می­مانند. حرارت 60 درجه را 15 تا 20 دقیقه تحمل می­كنند، سالمونلاها مدت 13 ماه در لاشه­های آلوده نگهداری شده در یخچال، 120 روز درآب، 280 روز در خاك باغچه و مدت بسیار طولانی در شیرخشك­های بدون چربی و موادغذایی دارای تخم مرغ زنده می­مانند. سالمونلاها نسبت به سرما مقاوم بوده و مدت3 ماه در برف و یخ زنده مانده واز این طریق می­توانند اپیدمی به­وجود آورند. كلرامنفیكل استرپتومیسین و بسیاری از آنتی بیوتیك های وسیع الطیف بر آن موثرند پنی سیلین بر آن كاملا بی­اثر است. سالمونلاها همچنین نسبت به املاح صفراوی مقاومند وبه همین دلیل از این مواد نیز علاوه بر رنگ­ها در تهیه محیط‌های غنی‌كننده استفاده می‌كنند Aksoy, 2004)).

 

 

 5-1-2- خواص كشت

 

 

اعضای این جنس هوازی بی­هوازی اختیاری می­باشند. مزوفیل بوده و رشد بهینه­ی آن در دمای 37درجه است.با این­حال برخی از سالمونلا­هادر شرایط شدید زیست محیطی مانند درجه حرارت بالای 54 درجه و سرمای 4-2 درجه را تحمل كنند. pH مناسب برای رشد آن 5/7-5/ 6 می باشد ولی pH حدود 9- 5/4  را می تواند تحمل كند و اگر pH پائین­تر از 4 برود باعث از بین رفتن میكرو­ارگانیسم می­شود. pH بیشتر از 9 صرفا از رشد آن جلوگیری می­كند. غلظت نمك 3/ 5 % بالاتر عاملی در جهت جلوگیری از رشد و تكثیر باکتری است (Jay et al., 2005 ; Doyle.M, 2007).

 

 

     اکثر سالمونلاها در روی آگار مغذی بعد از 24 ساعت پرگنه هایی به قطر 3-2 میلی متر و به رنگ سفید، خاکستری، مرطوب ،کروی، مسطح، برجسته و صاف ایجاد می کنند. اندازه و درجه کدورت پرگنه ها به نوع سروتیپ بستگی دارد. سالمونلاها در محیط های مایع نظیر آبگوشت مغذی و آب پپتونه رشد زیادی دارند Jay et al., 2005)).

 

 

     انواع محیط‌های غنی كننده می‌توان به آبگوشت تتراتیونات آبگوشت سلنیت F، آبگوشت را پاپورت (حاوی كلریدمنیزیم و سبزمالاشیت) و آبگوشت سلنیت سیستین اشاره كرده معمولاً بعد از 24ـ18 ساعت از محیط‌های غنی كننده روی محیط‌های انتخابی جامد كشت می‌دهند. از محیط‌های انتخابی و تفریقی می‌توان به محیط مك‌كانكی و محیط سالمونلا ـ شیگلا، محیط سبز درخشان، محیط آهن لیزین‌دار، محیط داكسی كلات سیترات یا محیط لیفسون(DCA)، محیط هكتوئن و محیط داكسی كلات ـ لیزین ـ گزیلور اشاره كرد. محیط بیسموت سولفات آگار، نیز به عنوان محیط انتخابی برای جداسازی سالمونلا مورد استفاده قرار می‌گیرد چرا كه قدرت انتخابگری این محیط بالاست. این باكتری‌ها معمولاً كربوهیدرات را با تولید اسید و گاز تخمیر می‌كنند.

 

 

. (D’ Aoust , 1991 ; D’ Aoust , 1998 ; Connie & Manuselis, 2000 ; Ferretti , 2001)

 

 

6-1-2 شرایط رشد سالمونلاها

 

 

سالمونلاها قادرند در محیط‌های ساده آزمایشگاهی رشد نمایند و از تركیبات ساده كربن‌دار به عنوان منبع كربن و انرژی و از تعداد زیادی از تركیبات ازت به عنوان منبع نیتروژن استفاده كنند (D’Aoust , 1998).

 

 

اكثر سالمونلاها پروتوتروف بوده و در میحط حداقل نمك با یك منبع كربن مناسب و یا محیط حداقل آمونیوم ـ گلوكز توانایی رشد دارند .(Morse, 1988)اكثر سویه‌های سالمونلاتیفی جهت رشد احتیاج به اسید آمینه تریپتوفان دارند. رشد سالمونلاها در دامنه حرارتی 5 تا 47 درجه است ولی دمای اپتیمم 37 درجه است .(D’ Aoust , 1991)

 

 

     بعضی از گونه‌های سالمونلا درجه حرارت‌های بالاتر از c ْ54 را نیز تحمل می‌كنند و عده‌ای دیگر خواص سرما دوستی را بوسیله رشد كردن در c ْ4ـ2 از خود نشان دادند. دردرجه حرارت‌های پائین امكان رشد و بقای سالمونلا بیشتر است. گزارش شده كه سالمونلاها نسبت به خشكی حساسند از این­رو انتشار آن­ها از طریق گرد و غبار و ذرات خشك كمتر از آب و مواد غذایی مرطوب است. بقاء سالمونلاها به طور نسبی به درجه حرارت محیط وابسته است .(Davis , 1996) به طوریكه در 55 درجه سانتی‌گراد در عرض یك ساعت و در 60 درجه در مدت 15 دقیقه نابود می‌شوند.

 

 

     پاستوریزاسیون شیر باعث از بین رفتن سالمونلاها می‌گردد. شیر به مدت 3ـ2 ثانیه در 66 درجه سانتی‌گراد، تخم‌مرغ به مدت 10 دقیقه در 55 درجه سانتی‌گراد و گوشت به مدت 10ـ15 دقیقه در 65 درجه سانتی‌گراد معمولاً عاری از سالمونلای زنده خواهند شد .(Alcamo , 1997)

 

 

   رشد سالمونلا بوسله منابع مختلف كربن و نیتروژن تنظیم می‌شود. اندازه باكتری و میزان متوسط اجسام نوكلئوزیدی هر دو مستقیماً به میزان رشد وابسته‌اند. حساسترین معرف تغییر در میزان رشد، RNA ریبوزومی است. به جز مواردی كه میزان رشد بسیارپائین است، میزان ریبوزوم‌ها درهر میلی‌گرم پروتئین‌ با میزان رشد متناسب است. به دنبال افزایش سنتز RNA به آرامی میزان سنتز پروتئین و DNA نیز افزایش می‌یابد. این مسأله به دلیل نقش تنظیمی RNA در سنتز تركیبات یافته‌ای است. آب نمك با غلظت بیش از 10% اثر كشندگی روی باكتری سالمونلا دارد   .(D’ Aoust , 1991 ; Quinn , 1994)

 

 

 7-1-2- بقا سالمونلا

 

 

بقای سالمونلاها در محیط تحت‌تأثیر عوامل مختلفی است. گزارش شده كه سالمونلا دابلین در زمستان حداقل به مدت 73 روز و در تابستان 119 روز در مدفوع زنده می‌ماند. بنا به تحقیقات بقا سالمونلاتیفی موریوم در چراگاه و خاك و بسته حدود 200 روز تخمین زده شده است(.(Connie & Manuselis , 2000

 

 

بقاء سالمونلاها به طور نسبی به درجه حرارت محیط وابسته است به طوری‌كه سالمونلاتیفی موریوم و سالمونلا كلراسیس در c ْ29 به ترتیب 4 و 9 روز و در c ْ60 به مدت 25 و 38 روز زنده می‌مانند. مقاومت به حرارت در مورد سالمونلایی كه در یك محیط غنی از مواد مغذی رشد می‌كنند و یا در محیطی با aw كم هستند بیشتر از آنهایی است كه در یك محیط فقیرند. بررسی‌ها نشان داده كه اگر سالمونلا تیفی موریوم در معرض محیط اسیدی ملایم (6 – 5/5) قرار گیرد سلول تا pH > 5/4 را تحمل می‌كند Foster , 1995)).

 

 

 8-1-2- زیستگاه

 

 

سروتیپ­های جنس سالمونلا از مهم­ترین باكتری­های میله­ای گرم منفی، عامل التهاب ­های روده­ای حاصل از مواد غذائی است كه با منشا انسانى و حیوانى پراكنش وسیعى در طبیعت دارند. زیستگاه اصلی سروتیپ­های سالمونلا، روده جانورانی همانند پرندگان، خزندگان، جانوران مزرعه­ا ی و انسان می­باشد .می­تواند از ماهی و لاك­پشت نیز به­طور مستقیم انتقال یابد. انتشار این باکتری از حیوان به حیوان دیگر و استفاده از مواد غذایی دامی آلوده به سالمونلا توجیه کننده این مطلب است که حیوانات به عنوان مخزن باکتری می­باشند MIRZAIE,2010)).